Percepire il DNA

Nature Biomedical Engineering (2023) Citare questo articolo

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La quantificazione di una singola molecola della forza e della specificità della sequenza delle interazioni tra proteine ​​e acidi nucleici faciliterebbe l'indagine del legame proteina-DNA. Qui mostriamo che gli eventi di legame tra la ribonucleoproteina Cas9 cataliticamente inattiva e qualsiasi breve sequenza predefinita di DNA a doppio filamento possono essere identificati rilevando cambiamenti nella corrente ionica mentre nanostrutture di DNA lineare con codice a barre opportunamente progettate con sporgenze di DNA a doppio filamento leganti Cas9 traslocano attraverso nanopori allo stato solido. Abbiamo progettato nanostrutture di DNA con codice a barre per studiare le relazioni tra la sequenza del DNA e la specificità di legame del DNA, l'efficienza di legame del DNA e la tolleranza al disadattamento del DNA di Cas9 a livello di singolo nucleotide. Il rilevamento basato su nanopori di nanostrutture con codice a barre del DNA può contribuire a migliorare la progettazione di ribonucleoproteine ​​efficienti e specifiche per applicazioni biomediche e potrebbe essere sviluppato in test sensibili di rilevamento delle proteine.

Il riconoscimento delle sequenze di acidi nucleici da parte delle proteine ​​è fondamentale per la biologia. A causa della specificità del legame proteina-DNA, le interazioni tra queste biomolecole costituiscono la base di molti strumenti di biosensori, tecniche di ingegneria biomolecolare e nuove terapie1,2. In particolare, i sistemi clusterizzati di brevi ripetizioni palindromiche regolarmente interspaziate (CRISPR)/dCas9 sono emersi come potenti strumenti per l'espressione genica mirata e per la diagnostica, e attualmente è in corso un lavoro sostanziale per migliorare l'efficienza e la specificità di CRISPR/Cas3,4. È quindi essenziale sviluppare test semplici e sensibili che analizzino le interazioni tra acidi nucleici e proteine ​​nei loro stati ripiegati e funzionali, per catturarne il comportamento nativo. Inoltre, è fondamentale che queste metodologie siano sensibili alle differenze di sequenza dei singoli nucleotidi, che possono avere un impatto drammatico sul legame.

Il rilevamento degli impulsi resistivi con nanopori allo stato solido è un metodo interessante per valutare gli eventi di legame. La tecnica offre la flessibilità necessaria per studiare DNA, RNA e proteine ​​nel loro stato nativo con un unico sistema di rilevamento. Il rilevamento dei nanopori si basa sulla misurazione dei cambiamenti nella corrente ionica mentre le molecole vengono guidate attraverso un poro nanometrico utilizzando un campo elettrico applicato. La variazione della corrente ionica dovuta a un evento di traslocazione riflette la dimensione, la forma e la carica della molecola5. Esistono due tipi di nanopori: biologici e allo stato solido. Sebbene i nanopori proteici di derivazione biologica siano ideali per il sequenziamento del DNA6, i nanopori allo stato solido offrono il controllo sulla dimensione dei pori durante il processo di fabbricazione, consentendo il rilevamento di un'ampia gamma di analiti.

Sebbene questa versatilità consenta l'analisi di una varietà di biomolecole, la mancanza di specificità nel rilevamento rappresenta anche una sfida per il rilevamento multiplex, in cui i target di interesse dovrebbero essere facilmente differenziati. Per superare questa barriera, sfruttiamo la nanotecnologia del DNA, che consente la progettazione e l'assemblaggio di nanostrutture personalizzate che contengono siti di legame specifici per le proteine ​​di interesse7.

In questo articolo, produciamo nanopori allo stato solido estraendo capillari di quarzo, noti anche come nanopipette, da utilizzare come strumento di rilevamento generale. Il DNA a doppio filamento (dsDNA) crea una caduta di corrente ionica nel segnale del nanoporo. Quando si lega un analita come una proteina al dsDNA, vengono creati picchi di corrente secondaria. Progettando siti o sequenze di legame specifici lungo un filamento di DNA, viene prodotto un modello identificabile. Questa impronta digitale è osservabile come una firma unica di picchi nella corrente ionica. L'etichettatura e la mappatura di sequenze di DNA nativo mirate nei nanopori è stata precedentemente realizzata utilizzando una varietà di metodi, tra cui sonde di acido peptidico nucleico8,9, legatura biochimica10, fattori di trascrizione11 e modificazione chimica con metiltransferasi e biotinilazione12. Recentemente, è stato dimostrato l'uso dell'analisi dei nanopori per misurare il legame di una variante di Cas9 cataliticamente inattiva o morta (dCas9) al dsDNA.2,13 Il nostro sistema si basa su questi lavori iniziali di prova di concetto introducendo nanostrutture di DNA progettate per l'utente hanno definito il test del target del DNA, ampliando così lo spazio di applicazione del rilevamento dei nanopori, della nanotecnologia del DNA e dello screening delle interazioni proteina-DNA. Qui dimostriamo che, se progettati e testati attentamente, i complessi dCas9 potrebbero agire come un'etichetta consentendo una mappatura altamente specifica del DNA per determinare cambiamenti di singole coppie di basi, il che è particolarmente importante per la diagnostica4,14.